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多色荧光标记在利用流式或荧光显微镜进行混合细胞免疫分群和单群细胞的多参数鉴定中是必不可少的。

Tandem dyes是一类组合式的荧光素，通常由两种不同的荧光分子耦联结合而成。Tandem dyes能够提供更加宽广的荧光发射波长，由此增加了多色标记的选择性。BioLegand公司除了提供常见的FITC、PE、Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 647、Alexa Fluor® 700、PerCP、APC和Pacific Blue荧光标记抗体外，还提供一系列的Tandem dyes如PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP/Cy5.5、APC/Cy5.5和APC/Cy7等标记抗体。

1. 首先需要了解您的流式细胞仪，以确定哪些荧光可以在您的仪器上使用。

a) 尽量选择一些可以应用于您的流式仪而又亮度高的荧光。例如PE作为最亮的荧光素而被首选。但如果所用的细胞样本具有很强的自发荧光时，不推荐用PE；此时可以选择APC，也能产生最亮的荧光。

b) 为表达量低的目标蛋白选择最亮的荧光；较弱的荧光可应用于高表达的蛋白检测。一般来说，白细胞当中CD45是细胞表面表达量最高的蛋白（请参考expression of common cell surface proteins ）。

c) 所选择的荧光之间发射光谱重叠尽量小。一般说来，如果荧光的最大发射光波长相差越大，那么荧光重叠就越小；当然，这是由具体的荧光光谱特征决定的，请利用相关的资料或网页查阅所选择荧光的光谱特征。我们不建议联用APC和 Cy5-Tandem荧光，因为他们之间的光谱重叠较大，荧光补偿不易调节。

d) 对比起其他荧光来说，tandem dyes有可能发生解偶联，并且对“光漂白”和使用固定剂“固定”时间更加敏感。因此通常情况，我们建议设置一个“tandem dyes单染”（single-stained）作为对照，并在其他通道检测荧光情况，用以确保未发生解偶联。例如，应用PE/Cy5单染做对照，分析PE通道的荧光信号。

e) 应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITC的荧光特性是pH依赖的。

f) 由于大部分荧光在强光下都易发生光漂白，所以荧光染色的样本避免暴露于强光下。

g) 检测荧光染色样本后，建议尽快上机检测（最好24小时内）。荧光染色后的样本如果长时间放置，容易发生荧光丢失、污染、细胞降解等现象；当然，有时使用固定剂可以起到一定的保护作用，但固定剂会对tandem dyes产生不利影响。

4. 掌握一些常见的细胞表面抗原表达情况：expression of common cell surface proteins

5. 了解一些其他的关于荧光染色的信息资料： http://www.biolegend.com/index.php?page=pfeatured&id=14

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