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| Multiplex Western blot检测方案 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Multiplex Western blot检测方案 传统的蛋白表达检测Western blot方法主要是以辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）偶联抗体和比色底物或化学发光底物作为检测系统，通常只能检测一种目标蛋白。但有些时候，我们需要同时检测多种蛋白表达情况，尤其是所要分析的蛋白大小不明确或相近时，传统的酶联显色方法的应用就受到限制了。对于多种目标蛋白的检测，最常用的方法就是将blot stripping后re-probe。这种做法不仅耗时、容易造成高背景，而且一些目标蛋白可能在stripping的过程中丢失。另外，显色或曝光时间的不确定性也使得结果的再现性不高。
近来，基于荧光定量蛋白western blot方法逐渐被推崇。荧光western blot由于能进行多种蛋白同时标记，并且蛋白信号稳定、节省实验时间和样本、简化实验操作，因而非常适合于Multiplex Western blot。选用光稳定性好的荧光素、良好的成像检测系统和低自发荧光转印膜，荧光WB的检测灵敏度完全可以和化学发光系统相比。
荧光Western Blot的优势：
l 单次实验同时定量检测多种目标蛋白，操作简单快速
l 检测灵敏度可完全达到化学发光系统水平
l 线性动态范围为化学发光法的10倍以上
l 简化实验操作步骤
l 无需使用额外的底物
l 可同时观测和定量单个蛋白的磷酸化和非磷酸化形式
Multiplex Western blot实验方案
一、实验材料
1. 凝胶和转印膜
根据蛋白分离的需要，选用预制的single-percentage或梯度凝胶，如Ready Gel® 和CriterionTM凝胶等，自制的聚丙烯酰胺凝胶凝胶也可用。
建议使用低自发荧光的PVDF膜，比如Pall FluoroTrans或Millipore Immobilon FL(见下图)，这些膜能减少背景荧光影响。NC膜、Pall FluoroTrans W PVDF和Millipore Immobilon-P PVDF由于具较高的背景荧光，故不建议使用于荧光WB检测。
.jpg) 图1. 各种不同型号膜产品在多个LED激发光源（blue，Green和Red）下自发荧光检测结果
2. 抗体
对于多个目标蛋白，选择不通种属来源（如mouse、rabbit和goat等）的结合一抗；然后根据所选的一抗，搭配不同荧光标记的二抗。美国Rockland公司提供丰富的、高质量的抗体，包括载脂蛋白、细胞周期/凋亡、细胞因子、细胞信号蛋白、酶类、细胞外基质、转录因子(NFkB)和泛素（Ubiquitin）等识别一抗（产品请见附表）。
所用的荧光除了Alexa™系列、IRDye等，DyLight™荧光标记二抗是非常好的选择。系列包括DyLight 488、DyLight 549、DyLight 649、DyLight 680 和DyLight 800。DyLight™具有荧光强度高、光稳定性好、高信噪比等特点，非常适用于Multiplex Western blot分析。
表1：Properties of DyLight™ Fluorescent Dyes:
ε(M-1 cm-1)：Molar extinction coefficient
如：
2. 相关溶液和缓冲液
² 采用PBS含0.05%-0.2% Tween（PBST）洗膜；
² 膜封闭液为PBST加入1% BSA或casein；
² 转膜Buffer：Towbin Tris-glycine buffer（192 mM glycine,25 mM Tris,pH8.3）+ 20% methanol (请参考 Protein Blotting Guide，Bio-Rad) 。
² PVDF膜用高质量的分析纯甲醇预湿。
3. 荧光成像系统
根据用于检测的荧光成像系统选择合适的荧光，实验室常见的用于荧光WB的系统：
l VersaDoc MP 4000(Bio-Rad)
l VersaDoc MP 5000(Bio-Rad)
l PharosFX system(Bio-Rad)
l Axio Imager.Z1 (Zeiss Micro Imaging Inc)
l Typhoon™ Imaging System
l Odyssey® Infrared Imaging system (LI-COR)
.jpg) 二、结果优化说明
1. 为不同的目标选择有明显光谱差异的荧光标记，这样通过检测系统后很容易区分和定量出目标蛋白。
2. 调整最适的一抗和二抗使用浓度。
3. 增强检测灵敏度
a) 尽可能地使用孔径小的凝胶，这样能更好地浓缩目标蛋白条带。
b) 荧光标记二抗应避光保存；荧光二抗孵育及洗涤过程中，避免把膜放于强光下；如果转印膜荧光染色后不立即进行结果检测，则应避光放置。
c) 不建议进行blot stripping和reprobing。
d) 为增强一抗的结合，建议应用4℃过夜孵育。
e) 转印膜不要过度孵育，长时间的封闭孵育（≥24h）可能导致目标蛋白的部分丢失。
4. 减少荧光背景信号
a) 溴酚蓝会产生强的荧光信号；选择使用不含溴酚蓝的Loading buffer上样，或转膜前把溴酚蓝给去除。
b) 考马斯兰染料同样会产生高荧光背景，确保用于孵育的容器和其他工具中未使用考马斯兰染料。
c) 避免其他可能产生荧光背景的物质污染，如凝胶碎片、Triton X-100、手套粉末、皮肤油脂等；建议使用干净的镊子进行操作。
d) 牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉反应的IgG, 由此产生非特异性背景。建议使用casein或BSA做封闭。
e) 二抗的孵育时间不能太长。
f) 避免使用圆珠笔标记转印膜，因为圆珠笔墨可能具自发荧光；如过必要，可使用铅笔做标记。
g) 一旦膜已浸湿，移动过程需小心谨慎。
h) 尽量做到样品吸取准确，确保所有样本都恢复至室温，并小心移取样本。
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