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细胞内因子的流式检测
一、 基本原理
细胞因子是可溶性小分子蛋白或者多肽，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内流式细胞术的发展是基于Jung与Picker采用monensin，PMA，BFA和Monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法刺激T细胞活化，阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内流式细胞术具有其它方法难以比拟的优点：快速，简便，灵敏度高，高效，安全，接近生物体的分析条件。
二、实验材料
（1）实验设备
1) 流式上样管及细胞培养皿或板
2) 25%CO2，37℃孵箱
3) 混匀振荡器
4) 离心机
5) 移液器、Tips
6) 流式细胞仪
（2）所需试剂
1) 荧光标记的细胞表面分子及胞内因子的单抗试剂
（Biolegend公司提供品种丰富的不同荧光标记的抗体，详情可以直接在达科为网站搜索，或者登陆biolegend的网站www.biolegend.com）
2) 红细胞裂解液RCL buffer（Biolegend Cat. #420301）
3) 激活剂
根据检测指标和标本的不同，需要选择不同的刺激剂和刺激时间，最常用为Ionomycin，PMA和PHA。
4) 阻断剂：
Brefeldin-A (Biolegend 1000x Cat. #420601， 使用前稀释到1X)
或者 Monensin (Biolegend 1000x Cat. #420701，使用前稀释到1X)
Brefeldin-A为Goligiplug，能破坏高尔基体的形成，抑制细胞因子的分泌。一般检测TNF-α，IL-6,Il-12.MCP-1的效果较好。
Monensin 为Goligistop，抑制细胞因子穿过膜。一般检测IL_3，IL-4，IL-5，IL-1，Il-13效果较好。
5) 固定剂Fixation buffer( Biolegend Cat. #420801)
含4%的多聚甲醛PBS溶液，室温保存。
6) 破膜剂Permeabilization buffer( Biolegend Cat. #421001)
含1％皂甙， 4℃储存。
7) Cell staining buffer
主要为FBA或者BSA，两者相差不大，一般是FBA，特殊情况可选择BSA。
三、常用的标本类型和处理方法
1、全血
使用肝素钠抗凝，不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2、外周血单个核细胞或者细胞系与T细胞克隆
调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％FBS 的PMI－1640培养基中。
四、对照
正确的系统对照可以减小误差。当试验结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
样品不加刺激剂，用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。。
2、 同型对照
与一抗相同来源，相同亚型或亚链，相同荧光标记的抗体，用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。
3、 激活对照
如用CD69细胞表面染色，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染。
4、 胞内染色对照
如用胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平，则通透与胞内染色可能步骤出了问题。
五、实验步骤
（以Biolegend产品检测全血样本的胞内因子为例） 1. 往刺激处理的全血中，每管加入１-2mL 1Xred blood cell lysis buffer（使用前，先从冰箱里面取出，用无菌水稀释，恢复到室温），振荡混匀，RT（室温）， 避光孵育5~10min。 2. 离心，350g，5min，弃上清。 3. 每管加入１-2 mL Cell staining buffer洗涤细胞，350g，5min 离心。 4. 分别加入0.25ug表面标记分子抗体, RT，避光孵育15-20min 5. 每管加入０.２５－0.5mL fixation buffer， RT，避光孵育20min。 6. 离心，350g，5min，弃上清 7. 每管加入1-2 mL 1Xpermeabilization wash buffer，350g，5-10min，弃上清。 8. 重复步骤7洗涤细胞两次 9. 加入100uL permeabilization wash buffer重悬细胞，分别加入对应的0.25-0.5ug胞内因子抗体，RT 避光孵育20min。 10. 每管加入1-2ml的１X Permeabilization wash buffer 洗涤细胞两次， 11. 每管加入0.5ml Cell staining buffer重悬，上机检测。
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